CRISPR) er en tredjegenerasjons genomredigeringsteknikk: CRISPR revolusjonerte verden

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) er en tredjegenerasjons genomredigeringsteknikk som har revolusjonert verden med sine høykapasitetsresultater. Den har blitt brukt til å behandle ulike biologiske sykdommer og infeksjoner. Ulike bakterier og andre prokaryoter (som arkea) har også CRISPR/Cas9-systemer for å forsvare seg mot fager. Det har blitt rapportert at CRISPR/Cas9-baserte strategier kan hemme veksten og progresjonen av trippel negativ brystkreft (TNBC) ved å målrette potensielt endrede resistensgener, transkripsjon og epigenetisk regulering. Disse terapeutiske intervensjonene kan bidra til å løse utfordrende problemer som medikamentresistens observert selv i TNBC. For tiden brukes ulike metoder for å levere CRISPR/Cas9 til målceller, for eksempel fysiske (mikroinjeksjon, elektroporering og hydrodynamiske moduser), virale (adenoassosiert virus og lentivirus) og ikke-virale (liposomer og lipid nanopartikler). Selv om ulike modeller har blitt utviklet for å studere de molekylære årsakene til TNBC, begrenser mangelen på sensitive og målrettede metoder for å levere genomredigeringsverktøy in vivo deres kliniske anvendelse. Oppsummert undersøker denne oversikten omfattende fremgangen, utfordringene, begrensningene og utsiktene for CRISPR/Cas9-behandling for TNBC basert på eksisterende bevis. Vi fremhever også hvordan kombinasjonen av kunstig intelligens og maskinlæring kan forbedre CRISPR/Cas9-strategier i behandlingen av TNBC.
Kreft er preget av ukontrollert celledeling, forstyrrelse av cellesyklusens kontrollpunkter og mutasjoner i tumorsuppressorgener (TSG-er) (Matthews et al., 2022). Blant de ulike krefttypene er brystkreft den vanligste krefttypen hos kvinner og har en høy dødelighet på verdensbasis (Waks og Winer, 2019). Brystkreft er en heterogen sykdom med ulike egenskaper, som histologiske og biologiske trekk, klinisk presentasjon og atferd, og respons på behandling (Weigelt et al., 2010). Klassifisering av brystkreft gir presis innsikt i diagnose av brystkreft og prognose for svulster. Bruken av vanlige biomarkører og klinisk-patologiske trekk har vært hovedkriteriet for klassifisering av brystkreft (Tsang og Tse, 2019). Prognosen og responsen på behandling av brystkreft påvirkes av en rekke faktorer, inkludert tilstedeværelsen av østrogenreseptor (ER), progesteronreseptor (PR), human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER2/neu), og histologisk grad, svulsttype og grad. størrelse og lymfeknutemetastase (Al-Tubaiti, 2020). Fem iboende molekylære subtyper av brystkreft er identifisert, inkludert luminal A, luminal B, HER2-beriket, basallignende og claudin-lav (Prat et al., 2015). TNBC er en molekylær subtype av kreft som ikke uttrykker all ER, PR og HER2 (Yin et al., 2020). Disse patologiske trekkene er assosiert med TNBC, noe som bekrefter dens raske progresjon og mer aggressive natur enn noen annen type brystkreft (Feng et al., 2018). I tillegg brukte Peru et al. (2000) mikroarray-teknologi for å reklassifisere brystkreft og identifisere fem iboende subtyper av brystkreft (Cadenas, 2012). Basallignende brystkreft er en subtype av brystkreft som har en trippelnegativ fenotype og er assosiert med rask progresjon. Det bør bemerkes at alle basallignende brystkreftformer ofte feildiagnostiseres som TNBC, men bare 77 % er TNBC. I motsetning til dette er 71–91 % av TNBC basallignende, noe som indikerer at disse to typene brystkreft overlapper hverandre og representerer forskjellige klassifiseringer (Wang D.-Y. et al., 2019). Dette skaper et behov for å karakterisere heterogeniteten til TNBC for å belyse prognosen og identifisere potensielle responser på nåværende og fremtidige behandlinger. I tillegg står TNBC for 15–20 % av alle brystkrefttilfeller og er mer vanlig hos kvinner under 50 år. BRCA1- eller BRCA2-mutasjoner er rapportert i omtrent 20 % av TNBC-tilfellene (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studier har også vist at TNBC har et distinkt immunmikromiljø som inkluderer høye nivåer av vaskulære endotelvekstfaktorer, tumorassosierte makrofager (TAM), tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) og andre molekyler involvert i tumorvekst og -migrasjon. Derfor er det avgjørende å forstå mikromiljøet til TNBC for prognose og behandling (Fan og He, 2022).
For å vurdere prognosen for TNBC og sikre effektiv behandling er nøyaktig diagnose, hovedsakelig basert på immunhistokjemi (IHC) for å oppdage ER, PR og HER2, og mammografi for å oppdage brystneoplasmer, viktig. Mammografi kan imidlertid ikke avbilde intratumorale trekk som nekrose og fibrose tilstrekkelig (Deepak Singh et al., 2021). Siden dårlig prognose og diagnose hindrer leger i å foreskrive riktige medisiner (Chaudhary, 2020), brukes ulike strategier for å forbedre behandlingen for pasienter med TNBC. For tiden brukes to legemidler, doksorubicin og cyklofosfamid, hos pasienter med TNBC og har vist gode resultater. I tillegg brukes andre platinabaserte legemidler, som karboplatin og cisplatin (Sikov et al., 2015). I tillegg har PARP-hemmere som Olaparib, Velaparib og PF-01367338 blitt brukt som potensielle cellegiftmedisiner for behandling av TNBC (Ishino et al., 2018). Siden det er rapportert at Wnt/b-Catenin-, NOTCH- og Hedgehog-signalveier er involvert i forekomst og progresjon av TNBC, kan det å målrette legemidler mot disse signalveiene være en viktig strategi (Aysola et al., 2013). Selv om kirurgi, strålebehandling og cellegift fortsatt er hovedbehandlingen for TNBC i dag, har det blitt gjort betydelige fremskritt i utviklingen av nye behandlinger, inkludert målrettet terapi, immunterapi, ulike CRISPR-relaterte genredigeringsverktøy som Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing og CRISPR/Cas9-målrettet genterapi. Her vil vi fokusere på ulike CRISPR-relaterte genredigeringsverktøy som brukes i behandlingen av TNBC. Blant dem har CRISPR/Cas9 fått bred oppmerksomhet.
Cas9n, også kjent som Cas9-nikase, er en genetisk modifisert variant av Cas9-proteinet utledet fra CRISPR/Cas9-genomredigeringssystemet (Gupta et al., 2019). I sin opprinnelige form inneholder Cas9-proteinet to nukleasedomener: RuvC og HNH, hvis hovedfunksjon er å spalte begge DNA-trådene. I Cas9n er imidlertid ett av nukleasedomenene, HNH, genetisk mutert og blir inaktivt. Derfor forblir HNH-domenet til Cas9n ikke-funksjonelt. Bare RuvC-domenet forblir aktivt, slik at Cas9n kan kutte eller lage brudd på enkelt-DNA-tråder (Trevino og Zhang, 2014). Sammenlignet med Cas9 kan Cas9n effektivt redusere off-target-effekter og nøyaktig forbedre cellereparasjonsmekanismer. Cas9n kan brukes til å løse ulike problemer, for eksempel å lage brudd på bestemte steder i dobbelttrådet DNA. For dette formålet ble to Cas9n-molekyler kombinert og brukt sammen (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) er en mitogenaktivert proteinkinase som fungerer som en nøkkelregulator under TNBC-metastase (Cronan et al., 2012).
MLK3 kan aktivere flere signalveier som fører til TNBC-metastase. For eksempel regulerer c-Jun N-terminal kinase (JNK)-veien cellemotilitet og nedbrytning av ekstracellulær matriks, og MLK3 aktiverer JNK-veien, og forbedrer dermed cellemotiliteten og gir invasive egenskaper (Rattanasinchai og Gallo, 2016). MLK3 regulerer også EMT. For å gjøre dette aktiverer den nedstrøms transkripsjonsfaktorer som Snail, Slug og Twist. Disse faktorene hemmer uttrykket av epitelmarkører og fremmer uttrykket av mesenkymale markører, noe som fører til tilegnelse av en metastatisk fenotype (Casalino et al., 2023). MLK3 har blitt observert å spille en rolle i ECM-ombygging og aktivering av proteaser som matriksmetalloproteinaser (MMP-er) som bryter ned ECM. Dette letter tumorcelleinvasjon og spredning til fjerne steder (Katari et al., 2019). Tidligere studier har derfor vist at MLK3 spiller en kritisk rolle i TNBC. Rattanasinchai og Gallo brukte TNBC-modeller for å studere rollen til MLK3 og fant ut at det fremmer kreftutvikling gjennom spesifikke signalveier. De brukte CRISPR/Cas9n til å redigere MLK3 og observerte en signifikant reduksjon i TNBC-metastase (Rattanasinchai og Gallo, 2016).
dCas9, ofte kalt inaktiv Cas9, er en modifisert derivatform av Cas9-proteinet. I motsetning til aktiv Cas9 mangler dCas9 endonukleaseaktivitet, noe som gjør det ute av stand til å indusere DNA-dobbelttrådbrudd. Derfor kan dCas9 brukes til å målrette presist mot spesifikke regioner i genomet uten endringer eller modifikasjoner i DNA-sekvensen (Wang et al., 2016). I dCas9 inaktiveres to endonukleaseproteiner, RuvC og HNH, ved å undertrykke viktige aminosyrerester. (Richter et al., 2016). Til tross for mangelen på DNA-spaltingsaktivitet, spiller dCas9 en rekke viktige roller i genetisk forskning og bioteknologi. For eksempel tillater det visualisering av spesifikke regioner i genomet, letter transkripsjonsregulering og fremmer epigenetiske modifikasjoner (Brocken et al., 2018).
Transkripsjonsfaktoren ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) spiller en spesifikk og kritisk rolle i å mediere epitelial-mesenkymal overgang (EMT), en cellulær prosess som skjer under embryonal utvikling, vevsreparasjon og kreftprogresjon. Den involverer transformasjonen av epitelceller til mesenkymale celler, noe som resulterer i endringer i cellemorfologi, motilitet, invasivitet, etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 hemmer flere epitelmarkører, som E-cadherin og Occludin, som er ansvarlige for å opprettholde celle-celle-adhesjon og polaritet i epitelceller i TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). I tillegg aktiverer ZEB1 visse markører som N-cadherin, vimentin og fibronektin (Konradi et al., 2014) og regulerer også gener involvert i cytoskjelettremodellering som Rho GTPaser og matriksmetalloproteinaser (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), i tillegg påvirker det også ulike signalveier som transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), Wnt-signalering, etc., og fremmer dermed tumorinvasjon og metastase i TNBC (Chen et al., 2016). Tallrike studier og vitenskapelige bevis indikerer at ZEB1 har et stort potensial som et verdifullt middel for deteksjon og terapeutisk intervensjon av TNBC. I en nylig studie brukte Waryah et al. en TNBC-modell og oppnådde fullstendig undertrykkelse av ZEB1 av dCas9. Dermed observerte de svært høy spesifisitet og nesten fullstendig hemming av ZEB1 under in vivo-forhold (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 er et genredigeringsverktøy kalt CRISPR/Cpf1. Det er avledet fra CRISPR/Cas-systemet, der begrepet Cas12 refererer til CRISPR-assosiert protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), som er fullstendig likt Cas9. Den eneste forskjellen er at det inneholder Cas12-proteinet. Sammenlignet med Cas9 har Cas12 noen unike funksjoner, som å generere klebrige ender under genredigeringsprosessen, mens Cas9 genererer butte ender (Wang et al., 2021). Denne egenskapen til Cas12 bidrar til den spesifikke DNA-manipuleringsteknologien. Som et protein som er i stand til å gjenkjenne og kutte mål-DNA presist, har det ekstraordinær allsidighet, noe som gjør det til et effektivt verktøy for en rekke bruksområder, inkludert genredigering (Pickar-Oliver og Gersbach, 2019).
I likhet med andre CRISPR-varianter er CRISPR/Cas12 også i stand til å slå ut eller aktivere gener i TNBC, og målrette gener som spiller en viktig rolle i patogenesen eller responsen på behandling (Yang og Zhang, 2023). For å oppnå denne prosessen ble det utviklet et guide-RNA (gRNA) som leder Cas12 til målgenet. Når Cas12 binder seg til målet, introduserer det dobbeltstrengsbrudd i DNA og aktiverer DNA-reparasjonsmekanismer. Under reparasjonsprosessen kan feil nukleotider bli inkorporert, noe som fører til genmutasjoner og tap av funksjon (Zhang et al., 2021a). I tillegg ble en forbedret versjon av Cas12-enzymet (kalt dCas12) også brukt til å aktivere gener. Ved å kombinere det med en transkripsjonsaktivator er det mulig å indusere visse gener, og dermed aktivere dem. Denne teknologien har stort potensial for å fremme aktiveringen av tumorsuppressorgener (Sultan et al., 2022).
Prime editing er en nyutviklet og ekstremt overlegen genomredigeringsteknologi. Den er i stand til å modifisere DNA-et til en organisme svært presist (Chen og Liu, 2023). Prime editing oppnås gjennom integrering av to hovedkomponenter: et modifisert CRISPR/Cas9-enzym og revers transkriptase. CRISPR/Cas9-enzymets rolle er å selektivt målrette presise steder i genomet, mens revers transkriptase bidrar til å modifisere DNA-et grundig på målstedet (Hassan et al., 2021). I primerredigeringsmekanismen involverer det første trinnet opprettelsen av et primerredigeringsguide-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Det inneholder målsekvensen og RNA-malen som tilsvarer det ønskede redigeringsstedet i mål-DNA-et. PegRNA-et introduseres deretter i målcellene sammen med en primerredigeringsnuklease (PE2). PE2 er et fusjonsprotein som består av et Cas9-enzym, en revers transkriptase og en primerredigeringsadapter (Martín-Alonso et al., 2021). Inne i cellen søker pegRNA- og PE2-komplekser etter det spesifikke DNA-et de ønsker å modifisere. Cas9-enzymet kutter DNA og lager en mal bestående av enkelttråder (Choi et al., 2022). Revers transkriptase bruker denne malen til å forberede DNA-et for redigering. I tillegg til kopiering av DNA er det også inkludert instruksjoner for redigering av RNA-malen. Til slutt brukes den nyopprettede DNA-tråden som en mal for å reparere bruddet i DNA-et, noe som resulterer i en endret DNA-sekvens som inneholder den ønskede modifikasjonen (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primerredigeringsmekanismer kan føre til omfattende mutasjoner i gener. Den kan målrette punktmutasjoner, innsettinger, delesjoner og til og med genutskiftninger (Anzalone et al., 2019; Chen og Liu, 2023). Primeredigering tilbyr flere fordeler i forhold til tidligere genomredigeringsteknologier. Disse inkluderer økt nøyaktighet, reduserte effekter utenfor målet og muligheten til å redigere DNA uten å være avhengig av DNA-dobbelttrådbrudd (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-teknologien ble opprinnelig utviklet for å beskytte bakterier mot plasmidoverføring og faginfeksjon, og ble senere omgjort til et effektivt RNA-basert DNA-målrettingsverktøy for genomredigering (Jiang og Doudna, 2017). I tillegg er det rapportert at CRISPR/Cas9-systemet er tilstede i henholdsvis 50 % og 87 % av bakterielle og arkeologiske genomer (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 er et potensielt verktøy for sletting, innsetting og korrigering av enhver unormal genetisk sekvens ved bruk av in vivo- og in vitro-moduser (Sabit et al., 2021). Dessuten har CRISPR/Cas9 vist seg å være en del av det adaptive immunsystemet på grunn av dets spesifisitet for målgener av interesse (Chen og Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 består av Cas9 og et enkelt guide-RNA (sgRNA). Cas9 er en endonuklease som er satt sammen av flere proteinkomponenter. I tillegg har Cas9 unike strukturelle og konformasjonsmessige egenskaper (Pacesa et al., 2022) ettersom den består av to lober: gjenkjenning (REC) og nuklease (NUC). REC-loben er videre delt inn i tre regioner: REC1, REC2 og brohelikser (Cromwell et al., 2018). NUC består av tre lober, nemlig RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH og protospacer adjacent motif (PAM) interaksjonsdomenet (fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA består av to komponenter, inkludert CRISPR RNA (crRNA) og transkodende lite RNA (tracer RNA) (figur 1). SgRNA kobler Cas9-proteinet til connexiner for å danne et aktivt kompleks, også kjent som effektorkomplekset (Richter et al., 2012). crRNA er et basepar på 18–20 nukleotider som spiller en kritisk rolle i å gjenkjenne mål-DNA-sekvenser. I tillegg parer crRNA seg med mål-DNA, og tracrRNA fungerer som et stillas for Cas9-nukleasen for å binde mål-DNA (Manghwar et al., 2019). På den annen side har PAM-sekvensen 3 nukleotider, som bekrefter, spesifiserer og medierer bindingen av effektorkomplekset til DNA. Cas9-proteinkompleks-subenhetene RuvC og HNH har katalytisk aktivitet (Richter et al., 2012; Asmamaw og Zawdie, 2021). HNH-nukleasedomenet til Cas9-subenheten kløyver DNA-strengen assosiert med crRNA. RuvC-nukleasedomenet kløyver andre DNA-tråder og genererer dobbelttrådbrudd (DSB-er), hvoretter to forskjellige reparasjonsmekanismer for DNA-brudd aktiveres (Jiang og Doudna, 2017) (figur 1).
Figur 1. Oversikt over CRISPR/Cas9 (A). Komponenter i CRISPR/Cas9-systemet: (i). Cas9-endonukleasen er ansvarlig for å kutte mål-DNA-sekvensen, (ii) et enkelt guide-RNA (sg) som følge av fusjonen av crRNA og tra-crRNA-kimærer. (to). Cas9 inkluderer flere komponenter som Rec I, Rec II, NUC-lapp (HNH og Ruv C er underkomponenter) og PAM-interaksjonsdomene (C) med tilsvarende funksjoner. CRISPR/Cas9-proteinkomplekset spalter DNA-sekvenser i ikke-komplementære og komplementære former (D). CRISPR/Cas9 redigerer genomet i tre stadier: gjenkjenning, kutting og reparasjon. Det designede sg-RNAet guider Cas9 og gjenkjenner den ønskede sekvensen gjennom den komplementære komponenten crRNA. Cas9 gjenkjenner PAM-sekvensen ved 5′-NGG-3′ og smelter DNAet, og danner en DNA-RNA-hybrid og aktiverer spalting. HNH-domenet til Cas9 kløyver den komplementære strengen, og RuvC-domenet kløyver den ikke-komplementære strengen. CRISPR/Cas9 reparerer dobbelttrådet DNA ved å bryte det ned på to måter: ikke-homolog endekobling (NHEJ) og homologirettet reparasjon (HDR). NHEJ reparerer dobbelttrådet DNA i fravær av fremmed homologt DNA gjennom en enzymatisk prosess, en feilutsatt mekanisme som kan sette inn eller fjerne tilfeldige DNA-sekvenser. HDR er svært spesifikk og krever homologe DNA-maler.
CRISPR/Cas9-medierte reparasjonsveier inkluderer ikke-homolog endekobling (NHEJ) og homologirettet reparasjonsmekanismer (HDR). NHEJ er en feilutsatt vei fordi den involverer innsetting eller sletting og ikke krever noe mønster under reparasjonsmekanismen. Den bruker tilfeldige nukleotider for å generere standardproteiner (Abbasi et al., 2021). Dette reparasjonssystemet består av fire komplekser som KU-komplekset, det krysskomplementerende proteinkomplekset type 4 (XRCC-4), DNA-endeprosesseringsenzymet og proteinkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU-kompleksproteinet har to underenheter, Ku 70 og Ku 80, og spiller en viktig rolle i NHEJ-mekanismen, siden reparasjonsmekanismen initieres ved binding av to underenheter (Ku 70 og Ku 80) til de butte eller nesten butte endene av mål-DNA-et (Abbasi et al., 2021), og fungerer som et stillas for å rekruttere andre NHEJ-relaterte faktorer til skadestedet (Yang et al., 2020). XRCC-4 og DNA-ligase består av henholdsvis 334 og 911 aminosyrer, og XRCC4-DNA-ligase IV-komplekset stimulerer ligering av DNA-ender (Chatterjee et al., 2015). DNA-endeprosesseringsenzym, også kjent som polynukleotidkinase 3'-fosfat, er et DNA-endeprosesseringsenzym. Det kan fjerne 3'P-gruppen i DNA og fosforylere 5'OH-gruppen under DSB-reparasjon. Det involverer også reparasjon av enkeltstrengsbrudd (SSB) ved hjelp av SSB-reparasjonsveien (Chatterjee et al., 2015). Proteinkinase DNA-PKcs er en DNA-avhengig proteinkinase som består av en katalytisk underenhet av PIKK-familien (fosfatidylinositol 3-kinase-relaterte kinaser) og ataksi telangiektasi-mutert (ATM), samt ATM- og Rad3-relaterte ATR-er, trådbrudd (DSB) og enkeltstrengsbrudd (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR er en mer nøyaktig og passende reparasjonsmekanisme fordi informasjonen kopieres ved å bruke den intakte formen av den homologe DNA-dupleksen, selv om det krever tilstedeværelse av søsterkromatider. Dette skjer i løpet av S/G2-fasen av pattedyrs cellesyklus. HDR forekommer hovedsakelig i gjærarter, men NHEJ er kritisk hos pattedyr (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Den komplette reparasjonsmekanismen er vist i figur 1.
Siden TNBC er forårsaket av genetiske og epigenetiske abnormiteter, kan korreksjon av ondartede genomiske/epigenomiske abnormiteter ved bruk av CRISPR/Cas9 være en rimelig terapeutisk tilnærming (Chen et al., 2019). I tillegg kan noen transkripsjonsfaktorer involvert i cellespesifikk transkripsjonsregulering vise unike egenskaper ved kreftceller, noe som tyder på at transkripsjonsregulering kan være en utmerket tilnærming for kreftbehandling (Drost et al., 2017). Å utnytte disse molekylære egenskapene til svulster, som genetiske, epigenetiske og transkripsjonelle defekter, for legemiddelutvikling kan forbedre kliniske resultater og redusere screeningskostnader. CRISPR er et potensielt genredigeringsverktøy som ikke bare kan oppdage og identifisere kreftfremkallende genomiske mål, men som også kan brukes til å redigere, undertrykke og epigenetisk modifisere onkogener i menneskelige celler (tabell 1) (Ahmed et al., 2021). Flere CRISPR-screeninger har blitt utført for å se etter gener assosiert med tumorsuppressorer, onkogener og legemiddelresistens. Bruken av CRISPR/Cas9 til å redigere ulike TNBC-onkogener er vist i figur 2.
Figur 2. Genredigering av ulike TNBC-onkogener ved bruk av CRISPR/Cas9, noe som resulterer i redusert tumorvekst og metastase. Disse onkogenene inkluderer CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 og CXCR7, Crypto1, ROR1 og ST8SIA, som er involvert i forekomst og metastase av TNBC.
Kreftcellemigrasjon, invasjon og epitelial-mesenkymal overgang (EMT) er assosiert med ITGA9. Tidligere studier har vist at ITGA9 er en nøkkelspiller i Notch-signalveien og spiller en interessant rolle i rabdomyosarkommetastase (Molist et al., 2020). I tillegg ble ITGA9 funnet å være nært assosiert med pasientprognose i flere tumortyper, inkludert brystkreft (Wang Z. et al., 2019). I tillegg viste bioinformatisk analyse av ITGA9 at uttrykket i TNBC var betydelig høyere enn i andre brystkreftundertyper. Forhøyede ITGA9-nivåer er assosiert med tumormetastase og tilbakefall hos TNBC-pasienter. Knockout av ITGA9 ved CRISPR/Cas9 resulterte i kreftstamcellelignende egenskaper (CSC), tumorangiogenese, tumorvekst og redusert metastase ved å fremme β-katenin-nedbrytning i TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 er et medlem av TGF-β-familien og er kritisk for tidlig embryogenese, vedlikehold av stamceller og kreftmetastase (Ishii et al., 2021). Også kjent som Tdgf-1, er det et onkogent GPI-forankret signalprotein involvert i reguleringen av dannelsen av primitiv stripe, mesoderm og endoderm, samt etablering av venstre/høyre asymmetri i utviklingen av kroppsorganer under embryogenese (Zhang et al., 2021b). I tillegg har Cripto-1 vist seg å være involvert i epitelial-mesenkymal overgang (EMT) som en stamcellemarkør (Zhang et al., 2021b). EMT er kritisk ikke bare for ulike prosesser som embryonal utvikling, fibrose og sårheling, men også for kreftinvasjon og metastase. I tillegg har Cripto-1 vist seg å samhandle med fire Notch-reseptorer og forbedre deres posttranslasjonelle modning (Brandstadter og Maillard, 2019). Notch-signalveien er kjent for å være involvert i vedlikeholdet av humane brystkreftceller. Studier har vist at CRISPR/Cas9-mediert knockout av Crypto-1 hemmer kreftvekst og metastase. Derfor kan Crypto-1 bli et viktig terapeutisk mål for TNBC (Castro et al., 2015).
XCL12-proteinet og dets kjemokinreseptor CXC (CXCR4 og CXCR7) spiller ulike roller i kreftcelleproliferasjon, vekst, migrasjon og invasjon (Wu et al., 2015). Disse kjemoreseptorene har blitt assosiert med utviklingen av TNBC gjennom flere signalveier i både in vivo- og in vitro-modeller (Wu et al., 2015). I tillegg er aktivering av CXCR4 og CXCR7 assosiert med større mottakelighet for metastase og dårlig prognose ved TNBC (Karn et al., 2022). Derfor kan knockout av CXCR4 og CXCR7 bli effektive legemiddelmålgener for behandling av brystkreft, inkludert TNBC. Studie av Yang et al. Yang et al. (2019) brukte CRISPR/Cas9 for å ko-knockout CXCR4- og CXCR7-genene og fant at TNBC-proliferasjon, vekst, migrasjon og invasjon ble betydelig hemmet (Yang et al., 2019).
Økte nivåer av miR-3662, et TNBC-onkogen, ble observert i brystkreftvev (Yi et al., 2022). Nedregulering av miR-3662 har vist seg å hemme vekst og metastase av brystkrefttumorer både in vivo og in vitro (Agarwal og Gupta, 2021). HBP-1 er en potent hemmer av Wnt/-catenin-signalering og er sannsynligvis ansvarlig for miR-3662-mediert vekst av TNBC-celler. Nylig fant Yi et al. at miR-3662-HBP1-aksen regulerer Wnt/-catenin-signalveien i TNBC-celler (Yi et al., 2022). På grunn av sin tumorspesifikke ekspresjon kan miR-3662 være et potensielt terapeutisk mål for TNBC. Dermed kan CRISPR/Cas9-mediert nedregulering av miR-3662 være en utmerket tilnærming for å utvikle nye legemidler for behandling av TNBC.
UBR5 er et 300 kDa nukleofosfoprotein som har blitt identifisert som en nøkkelregulator for tumorigenese, metastase og immunrespons i ulike kreftformer (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 har blitt rapportert å være sterkt oppregulert i TNBC-prøver og stimulerer ERα-funksjonen ved å indusere proliferasjon gjennom sin ubiquitinligaseaktivitet (Bolt et al., 2015). Studier av heleksomsekvensering av primære TNBC-prøver viste også økt uttrykk av UBR5, noe som tyder på dets rolle i utviklingen av TNBC. I tillegg viste CRISPR/Cas9-drevet delesjon av UBR5 signifikant hemming av TNBC-metastase og -vekst i eksperimentelle musemodeller. Dessuten gjenopprettet inkludering av UBR5 i en villtype-musemodell dens fulle funksjonalitet, mens denne effekten ikke ble observert i inaktiverte mutantstammer (Liao et al., 2017). Mangel på UBR5 er assosiert med økt apoptose, nekrose og hemming av tumorvekst i TNBC på grunn av dårlig angiogenese. På grunn av tap av UBR5 reduseres tumorspredning til fjerne organer, og UBR5 induserer unormal EMT hovedsakelig ved å redusere E-cadherin-ekspresjon (Zhang og Weinberg, 2018). Nylig ble UBR5 vist å være en svært viktig faktor i IFN-γ-indusert PDL1-transkripsjon i TNBC på grunn av mangelen på E3 ubiquitineringsaktivitet. RNA-transkriptomanalyse viste at UBR5 kan ha systemiske effekter på gener assosiert med IFN-γ-banen og fremme PDL1-transaktivering ved å øke aktiveringsnivåene av proteinkinase RNA (PKR) og dens signaltransdusere og aktivatorer, transkripsjon 1 (STAT1) og interferon regulatorisk faktor 1 (IRF1). Imidlertid har CRISPR/Cas9-mediert kombinert ablasjon av UBR5- og PD-L1-ekspresjon en synergistisk terapeutisk effekt enn begge blokkeringene alene, med betydelige effekter på tumormikromiljøet (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 kan dermed være et viktig verktøy for å hemme UBR5-funksjonen, og dermed undertrykke TNBC-metastase og tumorvekst.
ROR1 er et type I transmembranprotein som uttrykkes under kreft og embryonal utvikling, og har blitt identifisert som et onkoføtalt protein (Nicholas Borcherding, 2014). Den invasive oppførselen til ulike menneskelige kreftformer er assosiert med oppregulering av ROR1. Lovende resultater har blitt oppnådd fra in vivo- og in vitro-studier som involverer terapeutiske forbindelser rettet mot ROR1 (Chien et al., 2016). Forhøyede nivåer av ROR1 mRNA i brystvevsbiopsier har også blitt assosiert med aggressive basallignende brystsvulster (BL) og deres migrasjon til andre deler av kroppen. Dessuten har overekspresjon av ROR1 blitt identifisert som en prognostisk markør for utvikling av TNBC (Chien et al., 2016). Å dempe ROR1 ved hjelp av CRISPR/Cas9 for å undertrykke TNBC-vekst og metastase ville imidlertid være en effektiv strategi.
Sialyleringsprosessen involverer tilsetning av sialinsyre til glykokonjugater, som katalyseres av sialyltransferaser (ST-er). ST8SIA1 tilhører ST-familien og spiller en viktig rolle i patogenesen til ulike sykdommer som lymfatisk leukemi og kolorektal kreft (Chang et al., 2018). RNA-sekvensanalyse viser at ST8SIA1 er høyt uttrykt i brystvev hos TNBC-pasienter og er positivt korrelert med mutasjoner i tumorsuppressorgenet p53, noe som kan bidra til patogenesen til TNBC (Battula et al., 2017). I tillegg er ST8SIA1 involvert i metastase og tilbakefall av TNBC, noe som tyder på at det spiller en viktig rolle i forekomsten og utviklingen av TNBC. I en in vitro-modell av TNBC ble det vist at nedregulering av ST8SIA1 av CRIPSR/Cas9 blokkerer vekst og metastase (Battula et al., 2017). Dette tyder på at CRISPR/Cas9 kan være et viktig verktøy for å hemme funksjonen til ST8SIA1-onkogenet i behandlingen av TNBC.
NAT1 er et metabolsk enzym som katalyserer dannelsen av fase II xenobiotiske forbindelser og uttrykkes i nesten alt menneskelig vev. NAT1 kan bruke kofaktoren folat til å målrette acetyl-CoA (acetyl-CoA) selv i fravær av det aromatiske aminsubstratet (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studier har vist at NAT1 regulerer matriksmetalloproteinase 9 (MMP9)-funksjonen i brystkreftcellemodeller og beskytter mot reaktive oksygenarter (ROS) under glukosemangel (Wang et al., 2018). Sletting av NAT1 har vist seg å hemme pyruvatdehydrogenasekomplekset, noe som fører til mitokondriell dysfunksjon (Wang L. et al., 2019). I tillegg har diverse andre rapporter vist at NAT1-hemming ved bruk av små molekyler og siRNA-silencing kan redusere invasiviteten og proliferasjonen av brystkreftceller (Stepp et al., 2018). Nylig ble CRISPR/Cas9 brukt til å undertrykke NAT1 i brystkreftcellelinjen MDA-MB-231, noe som påvirket cellulær metabolisme avhengig av uttrykknivået. Denne studien viste også at NAT-1 er kritisk for progresjon og metastase av TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koordinert transkripsjon av onkogener reguleres av superforsterkere, transkripsjonsfaktorer og kofaktorer (Hnisz et al., 2015). I tillegg er en gruppe cyklinavhengige kinaser (CDK-er), som CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 og CDK13, nødvendige for transkripsjonsregulering. Blant dem er CDK7 involvert i fosforylering av RNA-polymerase II, som er svært viktig for initiering og ekspansjon av onkogentranskripsjon i patogenesen til TNBC. I en banebrytende studie hemmet delesjon av CDK7 ved CRISPR/Cas9 TNBC, noe som indikerer at patogenesen til TNBC er CDK7-avhengig (Wang Y. et al., 2015).
Studier har vist at mutasjoner i MYC og RBP (RNA-bindende protein) kan føre til apoptose, mens enkeltgenmutasjoner i MYC eller RBP ikke påvirker veksten av kreftceller (Einstein et al., 2021). Mer enn 1000 RBP-er i det menneskelige genomet har blitt screenet ved hjelp av et CRISPR/Cas9-basert bibliotek. Blant dem ble 57 RBP-er funnet å være kritiske for veksten av kreftceller med svært forhøyede MYC-nivåer (Wheeler et al., 2020). I tillegg er YTHDF2 viktig for å opprettholde TNBC-cellevekst og reduserer mengden metylerte transkripter under transkripsjon og translasjon på høyt nivå i kreftceller med høyere MYC-ekspresjon. I tillegg er YTHDF2 ikke essensielt for kreftceller, som er mindre avhengige av forhøyede MYC-nivåer for å forlenge overlevelsen til TNBC-pasienter (Einstein et al., 2021), noe som tyder på at det kan være et potensielt terapeutisk mål for legemidler som kan overvinne TNBC.
Sinkfingerproteiner (ZNF-er) utgjør omtrent 1 % av det totale menneskelige genomet. Studier har vist at ZNF kan regulere celleproliferasjon i ulike kreftformer, som leverkreft, brystkreft og kolorektal kreft (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Biblioteker generert av CRISPR-knockout har blitt brukt til å screene ulike tumorsuppressorgener (TSG-er) i brystkreftceller (Shalem et al., 2014). Siden den gang har en transkriptomisk studie av CRISPR/Cas9 ZNF319-deleterte brystkreftceller vist at ZNF319 er et tumorsuppressorgen som reduserer brystkreftproliferasjon og derfor er involvert i ulike potensielle signalmekanismer og andre biologiske funksjoner (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose er en type programmert celledød som er avhengig av tilstedeværelsen av jern. Det er kjent at utviklingen av ferroptose påvirkes av tilstedeværelsen av lipidperoksider. I tillegg er det rapportert at PKCβII viser tidlig lipidperoksidasjon, og økt lipidperoksidasjon er assosiert med ferroptose. Screening av et bibliotek av CRISPR/Cas9-medierte kinasehemmere viste at PKCβII er involvert i prosessen med lipidperoksidasjon, som er kritisk for ferroptose i MDA-MB-231-celler (Zhang et al., 2022). Dette tyder derfor på at knockout av PKCβII av CRISPR/Cas9 kan være et potensielt mål for et tumorsuppressorgen for behandling av ferroptose-relaterte sykdommer (Zhang et al., 2022).
Legemiddelresistens antas å være ansvarlig for omtrent 90 % av dødsfallene hos kreftpasienter, og er en av de største utfordringene i kreftbehandling (Bukowski et al., 2020). Resultatene indikerer at et tilstrekkelig antall gener relatert til legemiddelutstrømning, DNA-reparasjon, apoptose og ulike cellesignalveier er assosiert med legemiddelresistens (Haider et al., 2020). Blant dem har flere gener blitt målrettet av CRISPR/Cas9-verktøy og har vist lovende resultater i å redusere legemiddelresistens og øke effektiviteten av kreftbehandlinger (Vaghari-Tabari et al., 2022). I tillegg har høykapasitets CRISPR/Cas9-gen-knockout-screeningsbiblioteker blitt implisert i å modifisere funksjonen til potensielle legemiddelresistensgenmål (Shalem et al., 2015). For å identifisere paklitakselresistensgener ble RNA-sekvensering kombinert med genomomfattende sgRNA-bibliotekscreening brukt til å identifisere åtte kandidatgener, inkludert histondeacetylase 9 (HDAC9), som er assosiert med medikamentresistens hos pasienter med tilbakevendende TNBC (B et al., 2020). I en annen studie ble økt uttrykk av diserin/treonin og tyrosinproteinkinase (DSTYK) observert under overlevelse hos TNBC-pasienter behandlet med kreftmedisiner. Dessuten økte CRISPR/Cas9-mediert nedregulering av DSTYK betydelig apoptose av medikamentresistente kreftceller in vitro (SUM102PT-celler og MDA-MB-468-celler) og en in vivo TNBC-modell (Ogbu et al., 2021).
Selv om TNBC har unormal aktivering av MAPK-signalveien, er den kliniske effekten av MEK-målrettede terapier dårlig. En CRISPR/Cas9 genomisk bibliotekscreening viste at hemming av PSMG2 (proteom-assemblage chaperone 2) sensibiliserer TNBC BT549- og MB468-celler for MEK-hemmeren AZD6244. CRISPR/Cas9-nedregulering av PSMG2 endret normal proteasomfunksjon, noe som førte til autofagimediert demontering av PDPK1, og dermed ytterligere forbedret tumorceller i TNBC-musemodeller indusert av AZD6244 (MEK-hemmer) og MG132 (proteasomhemmer). Dermed kan proteasom- og MAP-kinase (MEK)-hemmere administreres synergistisk for å redusere tumorcelleproliferasjon (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 har også blitt brukt til å screene for tap av genfunksjon som fører til TNBC-resistens (Shu et al., 2020). Ge et al. forklarte mekanismen bak medikamentresistens hos kreftceller behandlet med JQ1, en BET-bromodomainehemmer (BBDI), i TNBC. Ved å bruke CRISPR/Cas9 fant de at sletting av rb1-genet førte til at TNBC ble resistent mot kreftmedisinen JQ1. Derfor er rb1-funksjonen viktig i responsen på JQ1-legemidler i TNBC. De rapporterte også at paklitaksel er en CDK4/6-kinase/mikrotubuli-hemmer, og kombinasjonen med BBDI-er som JQ1 kan gi lovende terapeutiske responser på medikamentresistente TNBC (Ge et al., 2020).
Det transkripsjonelle landskapet til langt ikke-kodende RNA (lncRNA) har blitt rapportert å være ansvarlig for resistens mot neoadjuvant behandling ved TNBC. Denne studien viser at fem forskjellige MALAT1 lncRNA-transkripter er høyt uttrykt i TNBC. I tillegg økte CRISPR/Cas9-mediert delesjon av MALAT1 følsomheten til TNBC BT-549-celler for paklitaksel og doksorubicin, noe som tyder på en potensiell rolle for MALAT1-resistens ved TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutasjoner i BRCA1 (BRCA1m) er heterogene og derfor vanskelige å oppdage. Målretting av PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), den syntetiske letale partneren til BRCA1, kan øke kjemosensitiviteten til TNBC-legemidler. Ved bruk av CRISPR/Cas9 økte sletting av PARP1 sensitiviteten til kreftmedisiner som doksorubicin, gemcitabin og docetaxel for mBRCA1-mutante TNBC-celler, noe som tyder på at PARP1 også er involvert i medikamentresistens i TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutasjoner i tumorsuppressorgenene BRCA1 eller BRCA2 er kjent for å øke sannsynligheten for å utvikle brystkreft hos mennesker. Behandling av disse pasientene krever bruk av PARP-hemmere. I tillegg har det blitt vist at knockout av nukleotid-bergingsfaktoren DNPH1 ved bruk av CRISPR/Cas9 kan fjerne det giftige nukleotidet 5-hydroksymetyldeoksyuridin (hmdU) monofosfat, og dermed forbedre responsen til BRCA-defekte celler på følsomhet for PARP-hemmere (Fugger et al., 2021). CRISPR/Cas9 og PARP1-hemmere kan dermed bli en viktig behandlingsstrategi for TNBC.
Penetrant glykoprotein (P-gp)-genet er et multiresistensgen som generelt er oppregulert i omtrent 41 % av alle TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-indusert legemiddelutstrømning har blitt identifisert som en nøkkelregulator for legemiddelresistens ved brystkreft. P-gp-hemmere har vist økt følsomhet for kreftmedisiner ved brystkreft (Famta et al., 2021). Dermed kan CRISPR/Cas9-mediert ablasjon eller undertrykkelse av P-gp og P-gp-hemmere være svært viktige metoder for å overvinne legemiddelresistens ved TNBC.
ATP-bindende kassetttransportør G2 (ABCG2) er kjent for å forårsake medikamentresistens ved TNBC (Palasuberniam et al., 2015), selv om det for øyeblikket ikke finnes rapporter om forholdet mellom CRISPR/Cas9 og ABCG2-silencing og inaktivering av tumorsuppressorgen. PTEN kan forsterke ABCG2-aktivering (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Derfor kan bruk av CRISP/Ca9 for å fjerne ABCG2 og kombinere det med en ABCG2-hemmer være en passende behandling for å overvinne medikamentresistens ved TNBC. Tabell 2 nevner CRISPR/Cas9 som retter seg mot alle resistensgener.
Tabell 2. CRISPR/Cas9 retter seg mot ulike TNBC-resistensgener for å sensibilisere celler for kreftmedisiner.
CRISPR/Cas9-biblioteker er potensielle verktøy for screening av genmutasjoner assosiert med kreftpatogenese (Chan et al., 2022). Denne screeningmetoden involverer fire trinn som (a) bibliotekkonstruksjon, (b) lentiviral transduksjon, (c) fenotypisk screening og (d) målgenanalyse. Selv om TNBC har unormal aktivering av MAPK-signalveien, er den kliniske prognosen for MEK-målrettet behandling for TNBC-pasienter som bærer mutasjoner i tumorsuppressorgener som PTEN, RB1 og TP53 svært dårlig.
I tillegg testet en gen-knockout-screening med CRISPR/Cas9 det mest potente og selektive molekylet, dehydrokatrol, som er rikelig forekommende i guatemalanske blomster- og bladekstrakter, for å forstå effekten av dehydrokatrol på MDA-MB-231. Mekanismer for selektiv cellecytotoksisitet. Mesenkymale stamcelleegenskaper hos TNBC-subtyper. Denne CRISPR/Cas9-baserte screeningen avslørte også at HSD17B11, et gen som koder for 17β-hydroksysteroid dehydrogenase type 11, er høyt uttrykt i MDA-MB-231-celler og resulterer i dehydrofalkarinol spesifikt for MDA-MB-231-celler (Grant et. al., 2020). Dette antyder dermed at CRISPR/Cas9 genomisk screening har stort potensial for å identifisere mekanismene som ligger til grunn for de krefthemmende egenskapene til potensielle naturlige forbindelser.
I tillegg ble sårbarheten til TNBC for kreft studert ved hjelp av en objektiv genomomfattende in vivo CRISPR/Cas9-screening, som viste en sammenheng mellom onkogene og tumorsuppressorveier. Det er rapportert at viktige komponenter i mTOR- og Hippo-veiene spiller viktige roller i tumorregulering ved TNBC. I tillegg har studier vist at farmakologisk hemming av mTORC1/2 og YAP-onkoprotein effektivt hemmer patogeniteten til TNBC ved hjelp av en in vitro-legemiddelmatrisesynergimodell og in vivo pasientavledede xenografter. Dessuten forsterker Torin-1-mediert mTORC1/2-hemming makropinocytose, mens verteporfinindusert YAP-hemming fører til TNBC-celledød. Samlet sett fremhever disse resultatene kraften og robustheten til genomomfattende in vivo CRISPR-screening for å identifisere nye og effektive behandlinger for TNBC (Dai et al., 2021).
Dysregulering av immunsystemet er en viktig faktor i tumorigenese. Kreftceller unngår immunforsvarets klarering ved å omgå forsvarsmekanismer, inkludert å forstyrre aktiviteten til immunceller i tumormikromiljøet og svekke immunsystemet. Derfor kan det å utvikle et forbedret immunsystem være en viktig tilnærming til å bekjempe svulster. Bruk av CRISPR/Cas9-basert genmodifisering adresserer flere problemer knyttet til immundysfunksjon fra forskjellige perspektiver. CRISPR/Cas9 har blitt brukt til å forbedre antitumorimmunitet mot brystkreft gjennom følgende veier (figur 3).
Figur 3. CRISPR/Cas9-immunterapi retter seg mot TNBC-celler. Tap av CDK5 og nedregulering av PDL1 og CD155 styrker immunforsvaret. På samme måte økte tap av A2AR og nedregulering av TAA-er som HER2, mucin 1 og TEM8 effektiviteten til CAR-T-celler i å drepe kreftceller. CRISPR/Cas9-drevet T-cellescreening har vist at forstyrrelse av p38-kinase forbedrer T-celle-antitumoraktivitet. T-celler modifisert av CRISPR/Cas9 øker uttrykket av TCR (T-cellereseptor), noe som resulterer i at T-celler har antitumoraktivitet.
Målet med immunterapi er å stimulere immunforsvaret til å angripe kreftceller. Overekspresjon av immunkontrollproteiner forhindrer vanligvis autoimmune reaksjoner, men kan hjelpe kreft med å unngå dem (Topalian et al., 2015). Disse proteinene forhindrer immunreaksjoner ved å binde seg til reseptorer på overflaten av immunceller. Flere kontrollpunktproteiner (som CD155 og PD-L1) retter seg mot PD-1-reseptoren på immunceller og uttrykkes i brystkreft, spesielt TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Nedregulering av PD-L1 eller dens reseptor ved bruk av CRISPR/Cas9 kan stimulere immunforsvaret til å angripe TNBC-svulster (Yahata et al., 2019). I tillegg har nedregulering av PD-L1-ekspresjon gjennom CRISPR/Cas9-mediert delesjon av CDK5 vist seg å hemme tumorvekst in vitro og in vivo (Deng et al., 2020). Veksthemming i in vitro- og in vivo-modeller av brystkreft antyder at shRNA-mediert reduksjon av CD155 kan ha en terapeutisk effekt på brystkreft (Gao et al., 2018).
CAR T-celler uttrykker CAR-er som gjenkjenner tumorassosierte antigener (TAA-er) og kan bruke knockdown av checkpoint-proteiner for å forbedre aktiviteten sin (Li C. et al., 2020). Det finnes ulike potensielle mål for CAR T-celleterapi ved brystkreft, inkludert flere TAA-er som HER2, mucin1 og TEM8 (Bajgain et al., 2018). Det finnes bevis for at CAR T-celler som retter seg mot mesotelin (overuttrykt i TNBC BT-459-celler) er mer effektive mot kreft når PD-1 slås ut ved hjelp av CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Å isolere T-celler fra pasienter og deretter redigere dem ex vivo er imidlertid en arbeidsintensiv og tidkrevende prosess. Selv om universelle T-celler kan redusere isolasjonskravene, bør donor-T-celler som uttrykker humant leukocyttantigen (HLA) klasse I og T-cellereseptor (TCR) fjernes for å forhindre graft-versus-host-avvik (Ren et al., 2017, 2017a). Ved bruk av CRISPR/Cas9 kan HDR samtidig eliminere TCR og HLA og slå ut genet som koder for CAR. Studier har vist at CRISPR/Cas9 kan brukes til å introdusere anti-CD19 CAR-er i TCR-locuset, og dermed effektivt produsere CAR-er uten å utarme T-celler (Dimitri et al., 2022). Multipleksteknologier har blitt utviklet for å generere allogene CAR T-celler ved samtidig å eliminere TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I-subenhet og andre proteiner som PD-1 og CTLA-4, som kan ha bedre antikreftegenskaper mot TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Bruk av CRISPR/Cas9 kan forbedre effektiviteten til CAR-T-celler. Adenosin er kjent for å ha immunsuppressive egenskaper og kan redusere kreftimmunitet ved å blokkere T-cellefunksjonen og aktivere adenosin A2A-reseptorer (A2AR) (Vigano et al., 2019). Å dempe A2AR ved bruk av CRISPR/Cas9 forbedret effektiviteten til CAR-T-celler in vivo betydelig (Giuffrida et al., 2021). T-celler er kjent for å vise ulike fenotypiske egenskaper som cellulær ekspansjon, differensiering, oksidativt stress og genomisk stress. CRISPR/Cas9-basert T-cellescreening avdekket forstyrrelse av 25 forskjellige T-cellereseptorkinaser. Blant dem har sletting av p38-kinase vist seg å forbedre antitumoraktiviteten til T-celler, noe som indikerer at p38-kinase er en nøkkelregulator for regulering av CAR-T-celler (Gurusamy et al., 2020).
T-celler kan genetisk modifiseres ved hjelp av CRISPR/Cas9 for å produsere høyt uttrykte TCR-er. Overføring av genetisk modifiserte T-celler til pasienter har vist sterkere antikreftaktivitet enn endogene T-celler. Derfor kan endogene TCR-er konkurrere med genetisk endrede TCR-er hos pasienter, noe som kan påvirke potensialet for kreftimmunterapi. For å overvinne dette problemet kan bruk av CRISPR/Cas9 for å fjerne endogen TCR-β i mottakerceller og deretter overføre TCR-β T-celler til kreftpasienter vise bedre antikreftimmunresponser uten behov for endogen seksuell konkurranse mellom TCR-er (Fan et al. 2018). Med unntak av CRISPR-modifiserte T-celler er TCR-er dermed tusen ganger mer følsomme for tumorantigener enn normale TCR-transduserte T-celler. I tillegg viser endrede T-celler generert av γδ TCR+ CRISPR i ulike leukemier høyere uttrykk av CD4+ og CD8+ T-celler enn standard TCR-overføring (Legut et al., 2018). Dermed kan modifiserte T-celler generert av CRISPR/Cas9 være en effektiv immunterapimetode for å overvinne TNBC.
Integriner er celleadhesjonsmolekyler som finnes i cellulære transmembraner og fremmer bindingen av celler til den ekstracellulære matrisen (ECM) (Hamidi og Ivaska, 2018). Dysregulering av integriner er assosiert med kreftutvikling og -migrasjon ved å endre den ekstracellulære matrisen, noe som fører til kreftcelleoverlevelse i sirkulasjonen (Hamidi og Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-mediert integrin-knockdown bremser tumorprogresjon, metastase og kolonisering i TNBC. Nedregulering av integrin a5 (ITGA5) har vist seg å redusere cellemigrasjon og -progresjon i andre kreftformer som lungekreft (Ju et al., 2017), noe som tyder på at integrin a5 også kan være en nøkkelfaktor i patogenesen til TNBC.
Å generere knockout-mus ved hjelp av tradisjonelle embryonale stamcellemetoder (ES-celler) er en arbeidsintensiv, tidkrevende og ineffektiv prosess. Det tar måneder og år å målrette ES-celler gjennom homolog rekombinasjon, avle kimære mus og deretter krysse dem med heterozygote mus for å produsere homozygote avkom. Kompleks krysningsavl er nødvendig for å lage mus med flere genetiske mutasjoner. Imidlertid har det oppstått mange problemer når man bruker mus generert ved ablasjon av ES-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9 eller ved mikroinjeksjon av CRISPR/Cas9-komponenter i befruktede enkeltcelleegg. For eksempel skjer introduksjon av endringer ofte på bialleliske loci og er ikke genspesifikk. Det ble nylig rapportert at ES-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9-teknologi samtidig kan sette inn bialleliske mutasjoner i opptil 5 gener (Nishizono et al., 2021). For dette formålet ble Cas9 mRNA og fem genspesifikke gRNA-er transfektert samtidig inn i ES-celler. Dette fremhever hvor lovende og effektiv denne prosedyren er, selv om disse mutasjonene kan ha blitt gitt videre da grunnleggerlinjer ble avlet for å produsere femdoble knockout-mus. Studien rapporterer også en overraskende oppdagelse: ES-celler er ikke lenger nødvendige for å lage genetisk modifiserte mus. I stedet, for å fjerne spesifikke genprodukter, ble Cas9 mRNA og gRNA injisert i embryoer i encellet stadium. Som et resultat har det blitt laget knockout-grunnleggerlinjer som teoretisk sett kan brukes til å studere konsekvensene av gendelesjon hos mus (Qin et al., 2016). Dermed tillater CRISPR/Cas9 opprettelse av transgene mus for å behandle TNBC til en lavere kostnad enn tradisjonell genteknologi. Ved hjelp av CRISPR/Cas-systemet er det utviklet en ny knockout-musemodell som med hell kan introdusere punktmutasjoner i ett eller flere endogene gener i TNBC. Basert på dette konseptet kan dyremodeller av TNBC også utvikles ved bruk av CRISPR/Cas9-mediert delesjon av BRCA1 og p53, noe som resulterer i tap av HR-reparasjon, genomisk ustabilitet og mutante fenotyper (Annunziato et al., 2020).
For tiden brukes ulike metoder som mammografi, magnetisk resonansavbildning (MR) og ultralyd for å diagnostisere TNBC. Disse metodene har imidlertid noen begrensninger. Mammografi brukes til å diagnostisere lokalt brystvev i stedet for metastaser, der kreftceller har migrert til andre organer. Ultralyd er ikke en pålitelig metode for å diagnostisere TNBC (Chen og Lee-Felker, 2023). MR har høyere sensitivitet enn ultralyd og mammografi, men den diagnostiske nøyaktigheten er begrenset (Sha og Chen, 2022). Vevsbiopsi er en invasiv måte å identifisere kreftceller på. I noen tilfeller kan imidlertid en biopsi gå glipp av kreftvev hvis nålen beveger seg bort fra interesseområdet. I tillegg er det svært dyrt og kan være traumatisk for pasienten. TNBC er en heterogen krefttype, så en biopsi gir kanskje ikke nok informasjon om krefttypen. Derfor er det et presserende behov for en ny diagnostisk pålitelig metode for å oppdage TNBC. CRISPR/Cas9 kan tjene som et svært sensitivt og minimalt invasivt alternativ for brystkreftdiagnose. For dette formålet kan CRISPR/Cas9-baserte strategier brukes til å forbedre PCR-metoder for diagnostisering av TNBC. Først brukes Cas9- og cpf1-proteinene i CRISPR-systemet til å fjerne uspesifikt DNA, og deretter kan disse to proteinene (Cas9 og cpf1) gjenkjenne PAM-sekvensen før de binder seg til mål-DNA-et (Deepak Singh et al., 2021). Dermed kan PCR identifisere mutasjoner assosiert med kreftutvikling. Flere studier har tatt i bruk denne CRISPR-baserte strategien for å oppdage forskjellige mutasjoner i forskjellige kreftformer (Safari et al., 2019). Dermed kan CRISPR-baserte PCR-metoder redusere avhengigheten av TNBC-diagnose av invasive metoder som biopsibasert immunhistokjemi.
Genotypiske endringer i hormonreseptorregulering har også blitt demonstrert i TNBC (Chen og Russo, 2009). CRISPR/Cas9-baserte PCR-strategier som bruker mikroarrayer for diagnostikk på stedet kan effektivt overvåke disse mutasjonene (Hajian et al., 2019). Det kan også gi helsepersonell relevant informasjon om spesifikke mutasjoner hos TNBC-pasienter, noe som kan bidra til å forbedre behandlingsforløpet. Denne kombinerte teknikken har imidlertid begrensninger. Derfor kreves det omfattende forskningsinnsats før denne CRISPR/Cas-PCR-metoden kan brukes i helsevesenet for diagnostisering av TNBC (Yang et al., 2019).